La investigación presentada con el objetivo: determinar la relación entre el Conocimiento de las Madres y su Actitud sobre el Tamizaje Neonatal en el Servicio de Neonatología, Hospital Departamental de Huancavelica, 2023. Método: Fue de enfoque cuantitativo, tipo descriptivo y diseño no experimental. Con muestra de 50 madres de recién nacidos. Se usaron como técnica la encuesta y de instrumento cuestionarios para Conocimiento y Actitud. Resultados: Edad de la madre fue de 21 a 36 años con un 50%, grado de instrucción fue secundaria con un 60%. El nivel de conocimiento fue de nivel medio con un 52%, en la dimensión teórica fue tanto bajo y media con 44% cada una, en la dimensión práctica fue de nivel bajo con un 58%. Con respecto a la actitud, fue positiva su manera de actuar con un 52%. De acuerdo a la relación entre el conocimiento en la dimensión teórica y la actitud fue alta (rho=0,689, p=0,000), la dimensión práctica y la actitud fue moderada (rho=0,496, p=0,000) y en general, la relación entre conocimiento y su actitud fue alta (rho=0,784, p=0,000). Conclusión: Existe relación significativa entre el conocimiento de las madres y su actitud sobre el tamizaje neonatal en el servicio de Neonatología, Hospital Departamental de Huancavelica, 2023.